Padronização e avaliação de um protocolo para extração de dna em papel de filtro utilizando amostras de plasmodium spp

Abstract

O preparo rápido de amostras e a simplificação da extração de DNA é um dos desafios para os diagnósticos moleculares da malária em áreas com pouca estrutura. As técnicas convencionais de extração exigem condições especiais para o seu preparo, várias etapas de manipulação, além de elevar o custo da realização do procedimento. O IBMP (Instituto de Biologia Molecular do Paraná) desenvolveu um kit de extração de DNA para tuberculose, com otimização das etapas utilizadas durante a extração convencional por meio da redução da utilização de reagentes e retiradas dos processos de lavagem, além de não necessitar de inclusão de álcool para os processos de purificação, permitindo uma resposta rápida e eficiente, além de oferecer um custo benefício acessível e também viabilizar a reprodução da técnica em qualquer ambiente. O objetivo desse estudo foi adaptar o kit de extração do IBMP, utilizado no diagnóstico de tuberculose, para extração de DNA de Plasmodium spp. Trata-se de uma técnica de extração in house e inclui o uso de amostras de sangue total armazenadas em papel de filtro impregnado com detergentes, que causam a lise das membranas celulares por desnaturação proteica, expondo o DNA do parasito, ao mesmo tempo em que ocorre a estabilização dos ácidos nucleicos, facilitando o armazenamento em temperatura ambiente e impedindo o crescimento de microrganismos. A técnica utiliza um agente caotrópico que vem em substituição ao tampão de lise dos kits de extração convencional. Esta nova técnica poderá facilitar a coleta e transporte de amostras em regiões de difícil acesso ou com pouco estrutura disponível, permitindo a extração de DNA em etapa única. Incialmente foram utilizadas amostras de DNA extraídos de P. falciparum, visando a padronização da curva para detecção linear de parasitos por microlitro. Diluições de Log10 (10.000/1.000/100/10 e 1 parasitas / µL) foram utilizadas para confecção da curva de regressão linear. Os resultados mostram um limite de detecção (LOD) de até 1 parasitas/µL. Para validação da técnica foram utilizadas 30 amostras de indivíduos atendidos pelo laboratório de referência no diagnóstico da malária (Cepem/Porto Velho), sendo 25 (83,33%) positivas para malária e 5 (16,66%) negativas, segundo a Microscopia óptica. A comparação entre as duas técnicas de extração (IBMP e Qiagen) demonstrou valor de Kappa 1,00 para ambas as espécies parasitárias (falciparum e vivax), indicando forte concordância entre os resultados, além de demostrar 100% de sensibilidade e especificidade com a extração Qiagen e Microscopia óptica. Os testes utilizando o protocolo do IBMP demostraram uma sensibilidade tão eficiente quanto a realizada com o kit Qiagen, demonstrando a viabilidade da reprodução da técnica aqui apresentada. Os resultados deste estudo servirão como validação de um novo Kit de extração rápida de DNA para registro na Agência de Vigilância Sanitária.